RESUMO
HTLV-1 is the virus that causes T cell lymphoma/leukemia in adults and a neurological disorder known as HTLV-associated myelopathy or tropical spastic paraparesis. One of the transmission means is through contaminated blood and its byproducts. Because of the risk of HTLV-associated infections, screening for HTLV was introduced for Brazilian blood donors in 1993. Most of the diagnostic kits used in the national blood banks are bought from foreign companies. Brazil does not have the technology to produce this material and there is a need to produce diagnostic systems with national technology. In this study, we show the expression of gp21/HTLV-1 in Escherichia coli and its reactivity towards monoclonal antibodies and the antibodies of infected patients. Expressing these proteins is the first step towards obtaining diagnostic kits with Brazilian biotechnology.
Assuntos
Clonagem Molecular , Produtos do Gene env/química , Vírus Linfotrópico T Tipo 1 Humano/química , Produtos do Gene env do Vírus da Imunodeficiência Humana/genética , Anticorpos Monoclonais/genética , Anticorpos Monoclonais/imunologia , Escherichia coli/genética , Escherichia coli/metabolismo , Expressão Gênica , Produtos do Gene env/genética , Produtos do Gene env/imunologia , Vetores Genéticos , Anticorpos Anti-HTLV-I/genética , Anticorpos Anti-HTLV-I/imunologia , Vírus Linfotrópico T Tipo 1 Humano/genética , Vírus Linfotrópico T Tipo 1 Humano/imunologia , Humanos , Immunoblotting , Reação em Cadeia da Polimerase , Produtos do Gene env do Vírus da Imunodeficiência Humana/isolamento & purificaçãoRESUMO
O HTLV-1 é o vírus causador da leucemia/linfoma de célula T no adulto e de uma desordem neurológica conhecida por mielopatia associada ao HTLV ou paraparesia espástica tropical. Um dos modos de transmissão é pelo sangue contaminado e seus subprodutos e, devido ao risco de infecções associadas ao HTLV sua pesquisa na triagem de doadores de sangue foi introduzida no Brasil a partir de 1993. Os kits diagnósticos utilizados nos bancos de sangue nacionais são na sua maioria comprados de empresas estrangeiras. O Brasil não detém a tecnologia para produção deste material e há a necessidade de produção de sistemas de diagnóstico com tecnologia nacional. Neste trabalho, mostramos a expressão da gp21/HTLV-1 em Escherichia coli e sua reatividade frente a anticorpos monoclonais e de pacientes infectados. Expressar tais proteínas é o primeiro passo para obtenção de conjuntos diagnósticos com tecnologia brasileira.
HTLV-1 is the virus that causes T cell lymphoma/leukemia in adults and a neurological disorder known as HTLV-associated myelopathy or tropical spastic paraparesis. One of the transmission means is through contaminated blood and its byproducts. Because of the risk of HTLV-associated infections, screening for HTLV was introduced for Brazilian blood donors in 1993. Most of the diagnostic kits used in the national blood banks are bought from foreign companies. Brazil does not have the technology to produce this material and there is a need to produce diagnostic systems with national technology. In this study, we show the expression of gp21/HTLV-1 in Escherichia coli and its reactivity towards monoclonal antibodies and the antibodies of infected patients. Expressing these proteins is the first step towards obtaining diagnostic kits with Brazilian biotechnology.
Assuntos
Humanos , Clonagem Molecular , Produtos do Gene env/química , Vírus Linfotrópico T Tipo 1 Humano/química , Proteínas Oncogênicas de Retroviridae/genética , Anticorpos Monoclonais/genética , Anticorpos Monoclonais/imunologia , Escherichia coli/genética , Escherichia coli/metabolismo , Expressão Gênica , Vetores Genéticos , Produtos do Gene env/genética , Produtos do Gene env/imunologia , Anticorpos Anti-HTLV-I/genética , Anticorpos Anti-HTLV-I/imunologia , Vírus Linfotrópico T Tipo 1 Humano/genética , Vírus Linfotrópico T Tipo 1 Humano/imunologia , Immunoblotting , Reação em Cadeia da Polimerase , Proteínas Oncogênicas de Retroviridae/isolamento & purificaçãoRESUMO
The retrovirus HTLV-1 is the etiological agent of the adult T-cell leukemia and HTLV-1 associated myelopathy/tropical spastic paraparesis. The proviral genome has 9,032 base pairs, showing regulatory and structural genes. The env gene encodes for the transmembrane glycoprotein gp 21. The development of methodologies for heterologous protein expression, as well as the acquisition of a cellular line that constituently expresses the recombinant, were the main goals of this work. The DNA fragment that encodes for gp 21 was amplified by nested-PCR and cloned into a pCR2.1-TOPO vector. After which, a sub-cloning was realized using the expressing vector pcDNA3.1+. The transfection of mammalian cells HEK 293 was performed transitorily and permanently. Production of the recombinant gp 21 was confirmed by flux cytometry experiments and the cell line producing protein will be used in immunogenicity assays.
Assuntos
Regulação da Expressão Gênica no Desenvolvimento/genética , Vírus Linfotrópico T Tipo 1 Humano/genética , Mamíferos/virologia , Glicoproteínas de Membrana/genética , Proteínas do Envelope Viral/genética , Animais , Linhagem da Célula , Clonagem de Organismos , Citometria de Fluxo , Reação em Cadeia da PolimeraseRESUMO
O retrovírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 é o agente etiológico da leucemia das células T do adulto e da paraparesia espástica tropical/mielopatia associada ao HTLV-1. O genoma proviral é composto por 9.032 pares de bases, contendo genes estruturais e regulatórios. A glicoproteína transmembrana gp 21 é codificada pelo gene estrutural env. O desenvolvimento de metodologias para a expressão heteróloga de proteínas, assim como a obtencão de uma linhagem celular que expresse a gp 21 recombinante constitutivamente são os principais objetivos do trabalho. O fragmento codificante da gp 21 foi amplificado por Nested-PCR e clonado no vetor pCR2.1-TOPO. Posteriormente, foi realizada a subclonagem no vetor de expressão pcDNA3.1+. A transfeccão da linhagem celular de mamíferos HEK 293 foi realizada de maneira transitória e permanente. A producão da gp 21 recombinante foi confirmada por citometria de fluxo e a linhagem celular produtora será utilizada em ensaios de imunogenicidade.
Assuntos
Animais , Regulação da Expressão Gênica no Desenvolvimento/genética , Vírus Linfotrópico T Tipo 1 Humano/genética , Mamíferos/virologia , Glicoproteínas de Membrana/genética , Proteínas do Envelope Viral/genética , Linhagem da Célula , Clonagem de Organismos , Citometria de Fluxo , Reação em Cadeia da PolimeraseRESUMO
O teste de solubilidade de hemoglobina S em tubo foi adaptado para uso em microplaca, promovendo variaçöes na concentraçäo de saponina da soluçäo de fosfato-ditionito de sódio-saponina e testadas quantidades variáveis de sangue de portadores de hemoglobinas normais e variantes. A leitura foi realizada na própria microplaca colocando-a sobre papel branco com linhas negras, os melhores resultados foram observados com concentraçäo de saponina a 1 por cento e 5 uL de amostra de sangue. Os resultados foram confirmados mediante leitura da mancha em papel de filtro, de Magalhäes e Arashiro. A variaçäo proposta mostrou ser reprodutível, confiável, prática, rápida e de baixo custo para ser utilizada na triagem de grandes amostras populacionais e na identificaçäo de doadores de sangue portadores de hemoglobina S.
